DNASTAR PrimerSelect引物怎样设计，以及DNASTAR PrimerSelect引物特异性又该怎样检查，这件事情的重点并不是点一下自动生成就能结束，而是需要操作者先动手把目标序列、扩增区域、引物长度、Tm值、GC含量还有产物长度这些内容都给设定清楚，PrimerSelect这个工具常被用来设计PCR、测序和杂交等实验里所需要的引物和探针，在比较新的DNASTAR PCR设计流程里面，操作者也可以在SeqBuilder Pro中先把目标区域选好，再去创建引物对，之后再回头查看和调整得到的结果。

　　一、DNASTAR PrimerSelect引物怎样设计

　　在利用PrimerSelect设计引物之前，目标序列本身需要先被整理干净，如果目标序列里面含有很多N碱基，方向被放反了，或者需要剪切的那个区域没有被弄明确，那么后面即使得到了再多的候选引物，也很难被直接用到实验里面去。

　　1、确认目标序列

　　操作者需要先把目标DNA序列导入进来，再去核对序列的方向、起止位置以及需要被扩增的那一段区域，如果只是想扩增某一个基因片段，就不要把过长的上下游序列不加限制地全部放进去，否则软件会给出很多看起来合格、实际上却并不符合实验目标的候选引物。

　　2、设置设计参数

　　操作者要在引物设计窗口里面，把产物长度、引物长度、Tm范围、GC含量以及允许的错配条件，一项一项地给设置好，一般情况下的PCR引物，会被控制在一个合适的长度和Tm范围里面，前面和后面这两条引物的Tm值，也不应被拉开得太大，GC含量若是过低，会影响到结合时的稳定程度，若是过高，则可能带来非特异性结合和二级结构方面的问题，在进行参数设置的时候，不能只去追求候选数量的多少，在实验当中的可用性是更加需要去关注的事情。

　　3、筛选候选引物

　　当候选结果被生成出来以后，操作者应当优先去查看产物的长度是不是与目标相符，然后再去查看引物的Tm值、GC含量、3'端的稳定性，还有软件所给出的评分情况，如果手头有多组候选引物，不要只去挑选排名最靠前的那一组，可以把目标区域所处的位置、是否跨越了突变点、是否避开了重复序列，以及后续测序是否方便这些因素，都结合到一起来做判断，对于突变检测或是克隆那一类的实验，还需要去确认引物所在的位置，不会对后续分析的目的造成破坏。

　　二、DNASTAR PrimerSelect引物特异性怎样检查

　　检查引物特异性的时候，不能只把眼睛盯在Tm值和GC含量上面，很多PCR实验的失败，并不是因为参数看上去不合格，而是引物二聚体、发夹结构，或者模板上面的非目标结合位点，没有被提前给排除出去，引物双链互补和假引发位点，都是设计失败时比较常见的风险点。

　　1、检查自互补和二聚体

　　操作者要去查看候选引物当中，是不是存在比较明显的自互补、前后引物之间的互补，还有3'末端的互补，特别是3'末端的互补，是相对比较危险的一种情况，因为它可能会让引物之间互相进行延伸，从而形成引物二聚体，如果有一组引物，它的评分表现还不错，但是3'末端的互补却十分突出，在实际的实验中还是有可能出现杂带，或者产量被降低的情况的。

　　2、检查发夹结构

　　发夹结构会让引物自身发生折叠，这样就会减少它与模板进行结合的机会，在检查时不能只是去看有没有发夹，还要看这个发夹结构的稳定性怎么样，以及它发生的位置在哪里，如果结构集中在3'末端附近，通常就更需要被谨慎地对待；如果只是比较弱的内部结构，那么就可以把它和其他候选结果放到一起，进行综合的判断。

　　3、检查非目标结合位点

　　在目标序列的范围之内，要去查看是不是有多个可能进行结合的位置存在，如果模板是来自基因家族、重复片段，或者是保守区域，仅仅依靠局部的序列去进行设计，是很容易出现非特异性扩增的，必要的时候，可以把候选引物拿到更大范围的序列库里面，再去做一次比对，比如用Primer-BLAST去检查，它有没有可能会把非目标的模板给扩增出来。

　　三、引物结果怎样进一步优化

　　PrimerSelect所提供的候选结果，仅仅只是设计的起点而已，在真正被用到实验当中之前，还需要结合实验的体系、模板的复杂程度，以及下游的检测方式，再去进行一轮筛选。

　　1、微调引物位置

　　如果候选引物集中在了重复区域、低复杂度区域，或者GC含量不太正常的区域，那么操作者就可以把目标扩增的范围，稍微地向前或者向后进行移动，很多时候并不需要去对参数做出大幅度的改动，只要把引物的位置换到一个更加稳定的区域上面，候选的质量就会得到比较明显的改善。

　　2、平衡前后引物

　　前引物和后引物这两者的Tm值、长度，还有GC含量，应当被调整到尽量接近的程度，如果其中一条引物明显偏强，另一条又明显偏弱，那么扩增的效率就会变得不太稳定，对于多重PCR这种情况，还需要额外地去检查不同的引物组之间，是不是存在着互补的关系，以此来避免一组引物对另一组的反应造成干扰。

　　3、保留设计记录

　　在设计工作完成以后，操作者需要把目标序列的版本、引物的序列、产物的长度、Tm值、GC含量、检查的结果，还有使用的目的，这些信息都给记录下来，后续的实验当中，要是出现了没有条带、有杂带，或者是测序质量不佳这些情况，就可以回到这些记录里面去进行判断，看看到底是引物设计这个环节存在问题，还是PCR体系和模板质量在当中出了状况。

　　总结

　　DNASTAR PrimerSelect引物怎样设计，以及DNASTAR PrimerSelect引物特异性怎样检查，可以按照这样的顺序去进行处理：先对目标序列进行确认，再去设置产物长度、Tm值和GC含量，在得到候选结果之后，去检查二聚体、发夹结构，还有非目标的结合位点。引物设计这件事，不能只是去看软件给出的排名，特异性、3'末端的稳定性、目标区域所处的位置，还有实验的用途，都需要被放到一起来做出判断，把候选的引物再拿到更大范围的序列当中去进行复核，这样做可以减少后续PCR出现杂带、弱扩增以及非目标扩增的可能性。