做基因序列分析时，真正耗时间的地方往往不在打开文件，而在判断哪些序列适合直接比较。实验样本一多，序列长度、方向、测序质量都会出现差别，有时只是一小段碱基质量不好，就会把整段比对带偏。DNASTAR常被用于序列整理、注释查看和多序列比对，处理这类数据时，先把原始序列理顺，再去看差异位置，结果通常更容易判断。

　　一、DNASTAR怎么进行基因序列分析

　　DNASTAR处理基因序列时，常会在SeqBuilder Pro和MegAlign Pro之间切换。前者适合查看、编辑单条序列，多个样本需要比较时，再把整理后的序列放进比对模块。

　　1、先检查准备分析的序列

　　序列导入以后，先看首尾和整体长度。这个环节看着简单，却能提前发现不少明显的数据问题。

　　①、启动【DNASTAR Lasergene】。

　　②、打开【SeqBuilder Pro】。

　　③、依次点击【File】→【Open】。

　　④、选择本次要处理的【序列文件】。

　　⑤、在【序列窗口】中查看碱基内容和序列长度。

　　⑥、记录连续出现未知碱基或明显缺失的位置。

　　2、整理目标片段和序列方向

　　①、在【SeqBuilder Pro】中打开目标【Sequence】。

　　②、定位实验需要比较的【目标区域】。

　　③、选中无关的首尾片段并进行编辑。

　　④、检查当前序列方向。

　　⑤、方向相反时使用【Reverse Complement】进行调整。

　　⑥、通过【Save As】保存处理后的文件。

　　不同样本如果比较范围不一致，MegAlign Pro往往会在两端产生大量没有分析价值的缺口。把目标区域先对齐，后面看结果会清楚很多。

　　3、进行多序列比对

　　①、打开【MegAlign Pro】。

　　②、把整理后的【DNA序列】加入当前项目。

　　③、检查各条【Sequence】名称是否对应正确样本。

　　④、进入【Alignment】相关设置。

　　⑤、选择当前任务使用的比对方法。

　　⑥、运行【Multiple Alignment】。

　　⑦、在结果窗口中查看碱基替换、插入、缺失和连续差异区。

　　二、DNASTAR基因序列分析结果异常如何检查

　　序列分析异常时，软件未必会弹出错误提示。比较常见的情况是程序正常完成计算，但排列出来的结果明显不顺，这时候要从异常开始的位置往回查。

　　1、某一段突然出现大量差异

　　如果前面的序列排列正常，到了某个位置后差异突然增多，先检查这一段原始数据，不要马上把整套参数全部改掉。

　　①、在【MegAlign Pro】中找到差异开始集中的位置。

　　②、记下对应的【Sequence】名称。

　　③、返回【SeqBuilder Pro】打开原始序列。

　　④、定位相同的【序列区域】。

　　⑤、检查附近是否存在连续【N】、缺失碱基或异常字符。

　　⑥、处理能够确认的问题后重新执行【Alignment】。

　　2、两条序列基本无法对应

　　①、分别打开两条【Sequence】。

　　②、检查两条序列的读取方向。

　　③、确认比较区域是否属于同一段基因。

　　④、对方向相反的序列执行【Reverse Complement】。

　　⑤、保存新的【Sequence】。

　　⑥、重新加入【MegAlign Pro】运行比对。

　　3、比对结果出现很长的缺口

　　①、打开当前【Alignment】结果。

　　②、找到连续出现【Gap】的位置。

　　③、核对该位置对应的【原始序列】。

　　④、进入【Alignment】参数页面。

　　⑤、查看当前缺口相关设置。

　　⑥、调整参数后重新运行比对。

　　⑦、保留调整前后的结果进行对照。

　　如果缺口随着参数变化大幅移动，就需要结合原始序列判断。单纯让排列看起来更整齐，并不能说明结果更可靠。

　　4、参考序列和样本总是对不上

　　有时候样本数据本身没有明显问题，但参考对象选错版本、选错区域，也会让结果一直偏离预期。

　　①、确认当前使用的【参考序列】名称。

　　②、检查参考文件的版本信息。

　　③、查看实验序列对应的【目标区域】。

　　④、核对两边是否属于同一段基因区域。

　　⑤、更换正确的【参考序列文件】。

　　⑥、重新执行【Multiple Alignment】。

　　5、同一批数据两次结果不一样

　　①、打开之前保存的【MegAlign Pro项目】。

　　②、核对当时使用的【序列文件】。

　　③、查看原来的【Alignment】设置。

　　④、检查当前文件是否做过剪切或方向调整。

　　⑤、使用原来的数据重新计算。

　　⑥、对照两次结果中的差异位置。

　　三、DNASTAR基因序列分析结果如何复核

　　比对图已经排得很整齐，也不能直接把所有差异都当成可靠结果。准备记录突变、缺失或者样本间差别时，再回原始序列核一次，会少掉不少误判。

　　1、回查准备记录的关键位点

　　①、在【MegAlign Pro】中找到目标差异位置。

　　②、记录对应的【Sequence】名称和附近碱基。

　　③、打开样本的【原始序列文件】。

　　④、定位相同的【碱基区域】。

　　⑤、核对差异位置前后的原始数据。

　　⑥、确认后再把该位置写入分析记录。

　　遇到原始序列附近存在连续未知碱基、明显缺口的情况，这个位点就要谨慎处理，不能只凭比对窗口里的字符变化下判断。

　　2、把分析时用过的文件和设置留好

　　①、保存当前【MegAlign Pro项目】。

　　②、另外保留一份【原始序列文件】。

　　③、保存已经整理过的【处理后序列】。

　　④、记下本次使用的【Alignment】设置。

　　⑤、导出需要继续核对的【比对结果】。

　　过一段时间再看同一批数据时，最容易忘掉的往往不是样本名称，而是当时到底改过哪些序列、用了什么比对条件。把这些资料放在一起，后面新增样本或者回查某个位置时会省下不少重复工作。

　　总结

　　DNASTAR做基因序列分析，结果出来以后还得留一点耐心去核对。比对图里看到的差异，有时来自样本本身，有时只是序列方向、截取范围或者原始数据质量带来的变化。碰到看着不太对的位置，回到原始序列再看一遍，往往比反复改设置更有用。平时把原始数据和分析记录留清楚，后面再碰到相似情况，也更容易判断问题出在哪。