克隆样本的Sanger测序结果中，读段开头或末端可能包含载体片段，低质量峰也经常出现在序列两端。整理这些数据时，既要去掉不属于目标插入片段的内容，也要避免把有效碱基一起剪掉。DNASTAR包含多个序列处理模块，以下以SeqMan Pro经典界面的非BAM项目为例，使用英文菜单说明操作。使用SeqMan Ultra时，界面入口有所不同，不宜直接套用这里的菜单路径。

　　一、DNASTAR怎么去除载体序列

　　SeqMan Pro可以在拼接前扫描指定载体，并排除匹配的载体片段。载体修剪与低质量末端修剪是两项操作，准备数据时应分别设置。

　　1、导入读段并保留原始文件

　　有峰图的测序文件便于检查载体与插入片段的交界位置。只有FASTA序列时，仍可进行序列匹配，但不能通过峰形确认边界附近的碱基质量。

　　①启动【SeqMan Pro】，选择【File】→【New】，建立新的分析项目。

　　②点击【Sequence】→【Add】，或在【Unassembled Sequences】窗口中点击【Add Sequences】，加入待处理的【.ab1】或【.abi】文件。

　　③核对读段名称和样本编号，选择【File】→【Save】保存项目，保留原始测序文件的独立副本。

　　2、给待处理读段指定正确载体

　　①在【Unassembled Sequences】中选中同一载体来源的读段，需要多选时按住【Ctrl】。

　　②使用【Vector】下拉列表选择实验实际使用的载体，核对列表中的载体名称。

　　③对其他载体来源的样本分别选择读段，设置对应的【Vector】，检查各行的分配结果。

　　载体不能只凭名称相近来选择，应与实验构建所用的序列及克隆区域对应。列表中没有合适定义时，应先补充、核实载体资料。选择载体后出现问号，表示尚未扫描，不能将其理解为已经完成去除。

　　3、运行载体扫描与末端修剪

　　①点击【Options】，在【Preassembly and Assembly Options】中勾选【Scan for Vector】。

　　②需要同时去除低质量末端时，勾选【Trim sequence ends】。返回序列窗口，通过【Trim Ends】检查【Quality Stringency】等质量修剪参数。

　　③对选中的读段点击【Scan Selections】，需要处理全部已导入读段时选择【Scan All】。

　　④返回【Unassembled Sequences】，检查【Vector】扫描状态和【Limits】中的保留范围。

　　扫描后，载体栏的勾号表示找到并去除了载体，倒置问号表示没有找到，空集符号表示整条读段被判断为载体，不再用于拼接。不要仅凭扫描执行完成就认定所有样本处理正确。污染序列筛除还可能排除整条读段，不能与载体片段修剪混用。

　　二、DNASTAR去除载体序列后怎么核对读长

　　这里要核对的是单条读段修剪后保留的长度。原始测序长度、保留读长和拼接后的重叠群长度，代表不同对象，不能放在一起比较。

　　1、用修剪报告核对前后长度

　　修剪报告同时记录质量修剪和载体去除的信息。如果两项处理一起运行，长度减少量不能全部算作载体长度。样本较多时，应按读段名称逐条核对，避免正反向文件对应错误。

　　①点击【Project】→【Trim Report】，打开当前项目的修剪报告。

　　②按序列名称查看修剪前长度、修剪后长度、修剪量及平均质量，记录长度变化异常的读段。

　　③用“修剪前长度减去修剪后长度”核对总减少量，并结合本次启用的【Scan for Vector】和【Trim sequence ends】记录处理原因。

　　④激活报告窗口，点击【File】→【Save Trim Report Info】，保存格式化或制表符分隔的报告。

　　2、结合保留端点和峰图检查边界

　　①在【Unassembled Sequences】中查看目标读段的【Limits】，记录保留区间的起止位置。

　　②对连续、无缺口且使用同一读段坐标的区间，按“终点减起点加一”核算长度。例如保留第46至720位，对应675个碱基。

　　③选中该读段，点击【Sequence】→【Show Original Trace/Flowgram Data】，打开峰图窗口。

　　④查看标有【Vector】的红色箭头和红色竖线，检查黑色修剪边界两侧的峰形与碱基。

　　被修剪的峰图区段会变暗，红色标记用于提示载体修剪位置，黑色边界用于显示当前保留端点。拼接后读段可能以反向互补方向显示，此时应先确认方向和坐标含义。不能拿拼接坐标直接套入单条读段的长度计算。

　　三、DNASTAR载体修剪后读长异常如何处理

　　读长缩短可能来自载体去除、质量修剪或手动端点设置。处理异常时，应回看修剪位置和原始信号，不要为了增加长度直接恢复两端。

　　1、排查过度修剪和载体未检出

　　①对明显变短的读段，重新打开【Trim Report】，核对载体分配与【End Trimming】参数。

　　②打开该读段的【Show Original Trace/Flowgram Data】，检查被排除区域是载体匹配区，还是低质量峰区。

　　③需要手动修正时，在【Trace Data】窗口中小幅移动黑色修剪边界，逐段核对新增或排除的碱基。

　　④对显示未检出载体的读段，返回【Vector】设置核实载体定义，再对选中读段执行【Scan Selections】。

　　载体片段也可能具有清楚的峰形，不能以峰好看作为恢复依据。只有确认被质量阈值排除的片段仍可可靠判读时，才考虑恢复。未检出载体也不能单独证明不存在残留，还应核对实际载体、测序方向和交界位置。

　　2、保存修剪结果并核对导出对象

　　项目中的端点调整不会直接改写原始测序文件。交付序列时，应区分单条组成读段与拼接一致序列，并重新检查导出文件中的实际内容。

　　①完成检查后，选择【File】→【Save】，保存当前项目及端点调整。

　　②已完成拼接时，在【Project Summary】下方面板中选中需要交付的组成读段。

　　③点击【Contig】→【Export Sequences】，选择【Single File】或【Multiple Files】，设置序列格式；按交付要求检查【Include Gaps】。

　　④重新打开导出文件，核对序列名称、方向、首尾碱基和实际长度，并与修剪记录逐项比较。

　　总结

　　去除载体序列的价值，在于让后续拼接和比对使用目标样本的信息。读长可以帮助发现异常，但保留得长并不等于结果可靠，载体边界、峰图质量和导出对象都需要对应检查。把原始文件、项目和修剪报告一起保存，后续出现长度疑问时就有依据可查。希望这些操作能帮助大家在清理序列时保留有效信息，也减少误剪造成的返工。