拿到一段蛋白质的氨基酸序列之后，假如手头还没有它的晶体结构，也没有预测出来的三维模型，那么先去看一看它在二级结构层面上的分布特点，往往是一个很自然的起点。下面要讨论的问题就很实际了：在DNASTAR这个软件包里面，蛋白质的二级结构预测到底该怎么去做，算出来的结果又该怎么解读，这些工作通常都是在它那个叫作Protean 3D的程序里完成的。Protean 3D被设计用来处理蛋白质序列和结构分析的事情，里面自带了Chou-Fasman、Deléage-Roux、Garnier-Robson和GOR等好几种广为使用的二级结构预测方法，用户可以根据自己的情况调用。

　　一、DNASTAR怎么做蛋白二级结构预测

　　在正式开启二级结构预测之前，有一步核对工作不能省略，那就是要先确认自己导进来的是不是一条蛋白质序列，而不是一条核酸序列，因为如果手里暂时只有DNA的碱基排列结果，就应当先把它按照正确的阅读框翻译成氨基酸序列，然后才进到蛋白分析的模块里去。

　　1、导入蛋白序列

　　先把Protean 3D这个程序打开，然后通过文件菜单或者拖拽的方式，把保存成FASTA、GenBank或者其他常见蛋白序列格式的文件给导进来，导入之后不要马上就开始计算，最好先花一点点时间检查一下序列的总长度对不对、它从哪个氨基酸开始，以及里面是不是混进了什么异常的符号，因为Protean 3D虽然能够支持fasta、gbk和pro等多种格式，但它对序列内容的规范性是有要求的。

　　2、打开二级结构预测

　　接着在序列分析的那个视图里，去找到跟二级结构相关的分析项，这一类分析在不同版本里可能放在不同的菜单下面，但多数时候，它是以一条或多条平行轨道的形式，把预测的结果直接画在序列旁边或上下，Protean 3D还有一个很方便的地方，就是允许同时把好几种预测方法的轨道都打开，这样一眼就能比较不同算法给出来的结构区域有什么相同或不同。

　　3、选择预测方法

　　在具体选用哪一种预测方法的时候，可以先从GOR或者Chou-Fasman这类常用的拿起，根据官方帮助文档的介绍，GOR IV是目前在Protean 3D里面比较新的二级结构预测方法；而Chou-Fasman背后的原理，是依据从已知晶体结构里统计出来的各个氨基酸形成特定结构的倾向，来推测新序列里相应位置的结构类型。

　　4、查看预测轨道

　　分析跑完之后，就可以在序列图形的那一栏里，去辨识出那些被标成螺旋、折叠、转角和无规则卷曲的区域了，如果碰到某个片段，好几种不同的算法都把它预测成了同一种结构，这段区域的可信程度通常就会高一些，值得投入更多精力去分析；反过来，如果不同算法的预测结果在同一个地方出入很大，那么在解释它的时候就要稍微保守一点，别过早下结论。

　　二、DNASTAR二级结构预测结果怎么解读

　　需要明确的是，二级结构预测并不是对蛋白质最终真实结构的一个拍板结论，它本质上只是根据氨基酸序列里所携带的信息，推测出局部区域的构象偏好，所以在解读结果的时候，主要去关注那些连续成片的区域、不同算法是不是大体一致，以及这些结构特征跟已知功能位点之间的关系。

　　1、看螺旋区域

　　一条序列里被预测为螺旋的那一段，通常意味着这一截氨基酸有较强的倾向去形成一个相对规整的螺旋构象，如果这段螺旋区域在序列上显得很长并且连续，又恰好坐落在跨膜区或者结构核心的附近，那么它就可能跟维持蛋白质整体结构的稳定、跨过细胞膜，或者参与分子之间的结合界面存在某种联系，这就值得再去深入查一查。

　　2、看折叠股区域

　　那些被预测为β股的区域，往往暗示着这段氨基酸有可能参与到β片层结构的形成当中去，如果在整条序列里，有好几段这种区域挨得比较近，那么在后续有了三维结构预测结果，或者找到了同源蛋白的已知结构之后，就应该去专门看一看它们是不是确实凑成了一片片层，而不是孤立地分开。

　　3、看转角和卷曲区域

　　转角和无规则卷曲这两个部分，从结构上来说通常要比螺旋和折叠灵活得多，它们很容易出现在那些用来连接不同结构域的环状区段里，或者直接暴露在蛋白表面，所以，一旦有突变位点恰恰落在这类区域，是有可能对局部的柔性、抗原表位，或者蛋白与蛋白之间的相互作用产生影响，但也不能单单凭一个二级结构的预测就敲定它一定具有某种功能后果。

　　4、看不同方法之间的一致性

　　假如拿着Chou-Fasman、GOR还有其他方法的结果放在一起看，发现它们在同一段序列上指出的结构趋势是差不多的，那么这段预测的可信度也就跟着上去了；要是某一段在这一个方法里被说成是螺旋，换到另一个方法里却变成了卷曲，那就说明这个地方的预测可能不太稳，这时候最好是结合序列的保守性、同源结构的信息，或者实验室手段拿到的线索，一起来做判断。

　　三、DNASTAR二级结构结果怎么复核

　　等到预测结果都摆出来以后，不宜直接拿它的描述当成蛋白质的真实结构写进报告或论文，在正式进入分析和讨论之前，比较稳妥的处理是再补充做几步工作，包括同源序列的比对、三维结构的对照，还有功能位点的相互核对。

　　1、和同源蛋白比对

　　可以把目标蛋白的序列拿去跟那些已经研究得比较清楚的同源蛋白放在一起比对，然后仔细看看二级结构上出现的变化，是不是落到了进化上比较保守的区域，因为保守区域里面发生的哪怕一点点结构上的改变，往往比那些多变的区域更值得引起注意。

　　2、结合三维结构查看

　　如果数据库里恰好有这个蛋白或者它同源物的PDB结构，再或者通过NovaFold这样的工具拿到了预测的三维模型，就可以在Protean 3D里面把三维结构给呈现出来，然后把之前预测出来的螺旋、折叠和环区，跟三维模型里实际对应的片段对一对，看看它们是不是能扣得上。

　　3、关注突变和功能位点

　　还有一个很重要的环节，就是把那些已知的突变位点、结合位点、发挥催化功能的活性位点，还有负责引导蛋白定位的信号肽序列，都一一标到序列上去，然后再看它们各自所落在的区域，在二级结构上属于哪一类，只有结构上的变化靠近了这些功能攸关的部位，解释起来才更有说服力，否则泛泛而谈意义不大。

　　4、保留方法和参数

　　在最终整理出来的报告或记录里，最好把这次分析用的是什么版本的软件、选了哪一种或哪几种预测方法、分析的序列版本，以及预测出来的主要结构区间，都清清楚楚地写下来，因为后面如果更换了算法，或者更新了序列版本，预测结果有可能发生变化，保留这些参数能让以后复核的人有据可查。

　　总结

　　把上面这些步骤串起来看，在DNASTAR里面进行蛋白二级结构预测，基本思路就是先进到Protean 3D里把蛋白序列正确地导进去，接着找到跟二级结构相关的分析轨道，选好合适的预测方法并让软件出结果；到了解读阶段，重点要留意的就是螺旋、折叠、转角和卷曲这几类结构在序列里是怎么分布的，以及不同预测方法给出的结论是不是彼此合拍；最后，一定要把预测结果仅仅当作结构分析和功能推断上的一条线索，后续还得拿它去跟三维结构、同源比对的结果以及实验数据放在一起双重核对，这样每一步才能走得比较稳。