看ORF图时，容易遇到这样的情况：正链上有一条长框，反链上也有一条，长度都像是目标蛋白；换个检测条件，原来的框又不见了。这时需要弄清软件究竟显示了什么。DNASTAR可以把符合条件的开放阅读框标出来，但起点选在哪里、序列是否完整，还得结合碱基和参考资料继续判断。

　　一、DNASTAR怎么查找开放阅读框

　　这项操作可以在SeqBuilder Pro中完成。它属于DNASTAR软件包中的序列编辑与分析模块，能同时查看核酸、ORF和翻译。

　　1、打开待分析文件

　　①点击【File】→【Open】，打开FASTA或GenBank等格式的核酸序列，切换到【Sequence】视图查看内容。

　　这里先看两件事：序列是不是本次要分析的那条，文件是否包含完整目标区域。如果只拿到一段测序读段，即使能找到ORF，也可能只覆盖蛋白的一部分。

　　2、选择遗传密码表

　　①打开【Sequence】→【Select Genetic Codes】。

　　②按物种和序列来源选择密码表，确认当前选项前有勾选标记。

　　部分线粒体等来源序列采用的密码规则与标准密码表不同。选错时，某些密码子会被解释成不同的氨基酸或终止信号，直接影响ORF边界。因此，看到提前终止的位置，暂时还不能判断它是不是样本中的真实变化。

　　3、填写ORF检测条件

　　长度门槛使用的是氨基酸数。比如填50，表示短于50个氨基酸的候选不显示，并非要求软件寻找恰好50个氨基酸的片段。

　　①点击【Sequence】→【ORF Detection Options】。

　　②在【Minimum ORF size】中填写筛选长度，留意界面上的氨基酸单位。

　　③先找带起始密码子的候选时，选择【Show only ORFs with start codon】。

　　④若文件可能缺少起始端，选择同时显示有、无起始密码子的选项，再点击【OK】。

　　4、显示并定位候选

　　①在【Sequence】或【Linear】视图中打开【Translations and ORFs】→【ORFs】，显示要看的阅读框。

　　②点击【Edit】→【Find】，选择【ORF】。

　　③在【Strand】中选【Forward】，点击【Find Next】，逐个查看正链结果。

　　④改为【Reverse】，继续查看反链；关闭查找窗口后，可以用【Edit】→【Find Again】继续。

　　⑤回到【Sequence】视图，从【Translations and ORFs】→【Reading Frame】显示对应翻译。

　　二、DNASTAR开放阅读框分析结果如何解读

　　图形上的框与线用于标出ORF，内部还可以出现起始、终止等标记。颜色和长短便于浏览，具体含义仍要对照序列查看。

　　1、上下两组阅读框怎么看

　　①对照【ORFs】中启用的选项，记录候选属于正链还是反向互补链。

　　②沿对应【Reading Frame】查看翻译方向，并记下候选在原序列中的位置。

　　双链DNA有六个可能的阅读框，两条链各三个。反链按反向互补方向读取，所以屏幕左侧未必是翻译起点。另外，截取序列后框编号可能变化，只记“第二框”不够，链方向和原始坐标也应一起保留。

　　2、框在边缘结束代表什么

　　序列文件的边界没有生物学上的终止含义。尤其是短测序片段，图上的ORF可能一直延伸到最后一个碱基。

　　①放大候选起始端，在【Sequence】中查看是否存在当前规则认可的起始密码子。

　　②沿相同阅读框查看另一端，确认是遇到了终止密码子，还是走到了文件边缘。

　　③将普通换行处前后的图形连起来看，避免把显示换行当成ORF断开。

　　④若序列为环状，继续查看编号起点两侧，检查候选是否跨越起点。

　　3、怎样核算蛋白长度

　　①根据候选范围核算核苷酸数，再与【Reading Frame】中的翻译比较，并注明是否包含终止密码子。

　　例如，一段从起始到终止的完整连续序列共303nt，包含101个密码子。末端终止密码子不编码氨基酸，因此对应100个氨基酸残基。含内含子的区域需要先考虑剪接；跨越环状起点的候选，也不能只拿两个端点直接相减。

　　三、DNASTAR中的ORF与预期对不上时怎么办

　　预期蛋白长度相近，可以作为查看候选的依据，但不宜据此硬选一个结果。下面几种情况，处理方法并不相同。

　　1、同一阅读框里有多个起始位置

　　同框出现多个起始密码子时，长度会随所选起点变化。直接选择让蛋白更长的那个位置，缺少足够依据。

　　①在【Reading Frame】中分别查看这些位置对应的氨基酸起点。

　　②与已注释CDS、参考蛋白的N端及序列比对结果比较，记录各起点的支持证据。

　　③暂时无法确定时，保留不同起点作为候选，不直接写成已确认的编码起点。

　　2、预期长ORF被分成几个短段

　　①若输入是真核基因组片段，先结合外显子、内含子注释，与成熟转录本或已确认CDS比较。

　　②若输入本应连续，在断开位置回查测序峰图或原始读段，检查不确定碱基、插入缺失和拼接边界。

　　一个碱基的插入或缺失，就可能改变后续密码子分组。即使删掉它能让翻译重新连续，也要先获得原始数据支持，修改时保留原序列和分析副本。

　　3、多个长ORF都像目标

　　长度接近时，可以把比较重点转到蛋白序列上。局部匹配与全长匹配提供的信息不同。

　　①分别对候选蛋白进行BLASTp搜索，比较覆盖度、一致性和匹配区段，结合保守结构域及目标蛋白的已知区域筛选；证据不足的候选继续保留。

　　总结

　　查找ORF之后，仍有一些问题需要回答：两端是否测全、起始位置有没有依据、翻译与参考蛋白能对上多少。把这些信息写清楚，比只记录“找到一条长ORF”更方便后续使用。遇到不符合预期的结果，也可以保留疑点，分别从序列来源、检测条件和原始数据中寻找解释，不必急着修改碱基。希望这些方法能帮助大家读懂DNASTAR的ORF图，在整理候选编码区和开展后续验证时少走弯路。如果有相关需求，欢迎联系咨询。