在分析新的测序片段、质粒中的插入片段或者功能未知的基因时，我们往往会把寻找开放阅读框当作判断这段序列有没有可能编码蛋白质的第一步；在DNAMAN里面同样可以方便地查看DNA序列在不同阅读框下的翻译情况，并借助这些结果去找出起始密码子、终止密码子，还有那些长度比较可观的开放阅读框。不过在动手操作之前，得先弄清几件事情：序列的方向对不对，它到底是不是一段完整的编码序列，以及你现在分析的对象究竟是线性的片段还是环状的质粒，免得一不小心把反向链或者非编码区错误地认成了要研究的目标蛋白。

　　一、DNAMAN怎么查开放阅读框

　　在正式开始查找之前，先把目标DNA序列在软件里打开。如果这段序列是从测序公司拿回来的，最好先用眼睛扫一遍碱基质量怎么样，里面是不是夹着不少代表不确定碱基的“N”；要是分析的是质粒全序列，就得提前搞明白插入片段在哪个位置、方向是正向还是反向，这些基本信息越清楚，后面跑出来的结果就越不容易出岔子。

　　1、找到开放阅读框分析功能的入口

　　把DNA序列文件打开以后，到软件菜单里去找跟序列分析或者翻译分析相关的板块，通常这里会有一个叫【Open Reading Frame】或者【ORF Search】的选项，不同版本菜单的名字可能会有一点出入，不过它们的内核都是按不同的阅读框去自动扫描起始密码子和终止密码子在哪里，这个功能是通用的。

　　2、选好要分析哪一条链

　　如果事先已经清楚地知道了目标基因的方向，那大可以只看正向的那条链；可要是方向还没有百分之百确定，比较稳妥的办法是直接把双链搜索或者六框翻译的模式给勾上，这样一来，正向的三个阅读框跟反向互补的那三个阅读框就会一并显示出来，不至于因为片段是反向插入的就把整个开放阅读框给漏掉了，像DNASTAR的SeqBuilder Pro这类软件也支持在ORF菜单里显示阅读框，并且让你去选择要不要搜两条链。

　　3、仔细查看起始和终止密码子的位置

　　等软件分析跑完以后，要重点去看每一项结果的起始位置、结束位置、整段ORF有多长，还有它落在第几个阅读框里；通常来说，一段靠谱的编码区应该有一个明明白白的起始密码子，中间的序列不能出现提前终止的情况，而且它翻译出来的长度也得大致接近你心里预期的那段蛋白，假如某一段序列在同一个阅读框里走了没多久就蹦出来好几个终止信号，那它十有八九并不是你真正想要找的那条开放阅读框。

　　二、DNAMAN开放阅读框长度条件怎么设置

　　ORF分析时用到的长度条件，主要是拿来过滤掉那些太短、不具参考意义的小片段；可要是把门槛设得太低，结果里会冒出来一大堆零碎的小ORF，看得人眼花缭乱，反过来门槛拉得太高，又可能把一些小肽、小蛋白或者还没来得及拼接完整的不完全片段给错过了。

　　1、弄清最小长度的单位

　　在ORF分析的参数设置窗口里找到【Minimum Length】或者“最小长度”这一栏，各个软件的习惯不太一样，有的是让你填氨基酸的数目，有的是填密码子的个数，也有直接填碱基数量的；比如SeqBuilder Pro在ORF参数那里，它就是让你用密码子的个数去指定要找的ORF最短是多长，所以你填数字之前一定得先搞清楚它的单位到底是什么，不要把想填300对碱基，结果一不小心填成了300个密码子，那就查出来完全是另一码事了。

　　2、根据分析的目的去选合适的阈值

　　假如你是在做质粒插入片段的验证，那完全可以参照你预期的蛋白长度来设这个门槛，比如目标蛋白大概有250个氨基酸，那把最小长度稍微往这个数值下面放一放，就能轻松排除掉那些很短的无意义片段；可要是在对一段完全未知的序列做初步筛选，一开始不妨把条件放宽一些，比如设在100个氨基酸左右，等拿到初步结果以后再结合功能注释和序列比对的信息去进一步判断；而要是你的研究目标本身就是一些小肽，那就绝对不能把这个值设得太高，要不然后面什么也抓不着。

　　3、把起始密码子的规则选对

　　多数情况下，分析真核生物或者普通蛋白的时候，我们都默认程序用“ATG”作为起始密码子；但在细菌、线粒体或者某些使用特殊遗传密码表的物种里，是有可能存在别的起始密码子的，如果DNAMAN里头提供了可选的遗传密码表，或者能让你手动指定起始密码子的种类，那就要根据样本的来源挑一个合适的规则，一旦起始规则选错了，ORF的起点就可能会被误认到前面去，或者被推迟到了后面，整段分析的基础就歪了。

　　三、DNAMAN查到ORF后怎么判断是否可靠

　　搜出开放阅读框只是拿到了一个候选名单，并不等于它就一定对应着生物体内真正存在的蛋白质，尤其是当你面对随机序列、载体骨架序列或者质量不太好的测序结果时，那些较短的ORF其实是相当常见的，所以不能逮着一个长度差不多的就直接下结论。

　　1、检查内部有没有提前出现的终止密码子

　　可以把那一段候选的开放阅读框翻译成氨基酸序列，然后从头看一遍，看那条序列里面是不是提前出现了代表终止信号的符号，一段完整的编码区里头是不该有提前终止的；如果看到了Stop，那就要倒回去看测序结果是不是存在插入、缺失，或者一开始把序列的方向弄反了。

　　2、跟预期的蛋白长度做个比较

　　假如你手头已经掌握了一些关于目标蛋白的基本信息，那可以直接把翻译出来的氨基酸长度、N端和C端的序列特征，跟预期值放到一起比一比；要是长度差得特别明显，就要优先去检查一下起始位点和终止位点是不是选得对，或者整段序列是不是遗漏了一部分而导致读码框发生了偏移。

　　3、结合BLAST或功能注释来做进一步验证

　　对于那些完全陌生的开放阅读框，可以先把翻译出来的蛋白序列导出来，再拿到数据库里去做同源性搜索，或者查查它有没有保守的结构域；如果一条ORF长度上虽然还行，可做完比对之后却找不到任何同源的参考序列，那就要给它多打个问号，不要轻易就认定它一定能表达出功能蛋白。

　　4、把可靠的ORF保存成注释

　　等到确认某一条开放阅读框确实值得继续往下做之后，最好把它存成一个Feature或者标注信息，顺手记下它的起点坐标、终点坐标、所在的阅读框以及翻译出来的那串氨基酸序列；这样后面再去设计引物、构建克隆，或者拿它跟别的蛋白做比对的时候，就可以直接调出来使用，不用再翻来翻去地找了。

　　总结

　　在DNAMAN里查找开放阅读框以及设置长度条件，整个操作的思路大致是这样的：先把DNA序列打开，然后进到ORF或者翻译分析功能里去，根据序列的实际情况去选正向单链、反向单链或者六框翻译模式；在设最小长度的时候，一定看清楚它的单位是按密码子数、氨基酸数还是碱基数来算，不要填错；门槛低了会带出一大堆短小的ORF，门槛高了又可能把一些短蛋白给漏掉；等到候选的ORF出来以后，还得把它放到起止密码子的准确性、有没有提前终止、预期长度的匹配程度以及同源比对的结果这几个条件下去综合判断，才能让最终的结论站得住脚。